Séquençage à haut débit pour la confirmation d’une infection suspectée par le 2019-nCoV identifiée par PCR quantitative en fluorescence
L’émergence du nouveau coronavirus 2019 (2019-nCoV), ultérieurement nommé SARS-CoV-2, a constitué une menace majeure pour la santé publique mondiale. Le diagnostic précis et rapide de ce virus est essentiel pour contrôler sa propagation et prendre en charge les patients. Bien que la PCR quantitative en fluorescence (FQ-PCR) soit la méthode de référence pour détecter le 2019-nCoV, ses limites dans certains cas ont nécessité le recours à des méthodes alternatives, comme le séquençage à haut débit (HTS), pour confirmation. Cet article présente un cas où le HTS a été utilisé pour confirmer une infection suspectée par le 2019-nCoV après des résultats discordants de FQ-PCR.
Contexte et importance de l’identification des agents pathogènes
L’identification de l’agent pathogène responsable à partir d’échantillons cliniques est cruciale pour diagnostiquer les maladies infectieuses émergentes comme la COVID-19. Au début de la pandémie, la FQ-PCR est devenue la méthode standard pour détecter le 2019-nCoV en raison de sa sensibilité et de sa spécificité. Cependant, les résultats de la FQ-PCR peuvent parfois être non concluants, notamment en cas de faible charge virale ou de qualité sous-optimale des échantillons. Dans de telles situations, des méthodes diagnostiques complémentaires sont nécessaires.
Présentation du cas et défis diagnostiques initiaux
Un patient de 65 ans, présentant une pneumonie et des antécédents de contact avec des cas de COVID-19 à Guangzhou (Chine), a été étudié. Trois prélèvements des voies respiratoires supérieures (écouvillons nasopharyngés) ont été collectés les 22 et 23 janvier 2020. Un premier test FQ-PCR avec un kit commercial a donné des résultats négatifs, avec des valeurs de seuil de cycle (CT) pour les gènes ORF1ab et N supérieures à 40. Malgré ces résultats, le lien épidémiologique et les symptômes cliniques ont maintenu la suspicion d’infection par le 2019-nCoV.
Un deuxième test FQ-PCR avec un kit différent a révélé des résultats faiblement positifs, avec des CT pour les gènes ORF1ab, E et N compris entre 31,58 et 38,45. Cette discordance a souligné les limites de la FQ-PCR pour les cas à faible charge virale.
Le séquençage à haut débit comme outil de confirmation
Face à ces résultats contradictoires, le HTS a été utilisé. Une bibliothèque métatranscriptomique a été construite à partir du premier écouvillon pharyngé (#1) et séquencée sur la plateforme Illumina NextSeq 550Dx, générant des lectures de 75 paires de bases. Les données ont été analysées via le système RPD-seq (Sagene Company, Guangzhou, Chine).
L’analyse a identifié dix lectures uniques alignées sur le génome du 2019-nCoV (GenBank MN908947.3), réparties uniformément sur les gènes ORF1ab, E et N. Cette distribution a confirmé un résultat faiblement positif plutôt qu’une contamination.
Critères diagnostiques et implications
Selon le plan national de diagnostic chinois, un résultat positif par FQ-PCR ou séquençage est requis pour confirmer la COVID-19. Dans ce cas, le HTS a permis un diagnostic définitif, malgré les limites de la FQ-PCR. Bien que plus coûteux et complexe, le HTS offre une sensibilité accrue et des informations génomiques complètes, en particulier pour les échantillons à faible charge virale.
Détails techniques du séquençage à haut débit
Le processus de HTS a inclus la construction d’une bibliothèque métatranscriptomique, le séquençage sur Illumina NextSeq 550Dx, et l’analyse via RPD-seq. Les dix lectures spécifiques au 2019-nCoV, couvrant des régions cibles de la PCR, ont renforcé la fiabilité du diagnostic.
Conclusion et perspectives futures
Ce cas illustre l’utilité du HTS pour confirmer les infections à 2019-nCoV lorsque la FQ-PCR est non concluante. Bien qu’inadapté au diagnostic de routine, le HTS améliore la précision dans les cas complexes. Des recherches futures devraient optimiser les protocoles HTS pour en réduire les coûts et faciliter son utilisation large.
En conclusion, l’intégration du HTS dans les workflows diagnostiques des maladies infectieuses émergentes renforce la détection des agents pathogènes. La combinaison de la FQ-PCR et du HTS pourrait améliorer la prise en charge des patients et le contrôle des épidémies.
doi : 10.1097/CM9.0000000000000792