Méthode de Dépistage Génétique pour l’Analyse du Nombre de Copies du Gène Survival Motor Neuron dans l’Atrophie Musculaire Spinal par Amplification Multiplexe de Sondes Dépendante de la Ligature et PCR Digitale en Gouttelettes
L’atrophie musculaire spinale (AMS) est une maladie autosomique récessive caractérisée par la dégénérescence des motoneurones de la corne antérieure de la moelle épinière, entraînant une faiblesse et une atrophie musculaires progressives. La maladie est principalement causée par des délétions homozygotes ou des mutations du gène survival motor neuron 1 (SMN1), induisant un déficit en protéine SMN fonctionnelle. Un gène paralogue, SMN2, diffère de SMN1 par une substitution nucléotidique unique (C→T en position 6 de l’exon 7). Cette transition provoque un épissage alternatif, produisant seulement 10 % de protéine SMN fonctionnelle. Cependant, SMN2 constitue la seule source de SMN chez les patients atteints d’AMS, et son nombre de copies (variant de 1 à 8) est inversement corrélé à la sévérité de la maladie. La détermination précise des copies de SMN1 et SMN2 est cruciale pour le diagnostic génétique, l’évaluation pronostique et les décisions thérapeutiques. Cette étude compare deux méthodes de dépistage génétique—l’amplification multiplexe de sondes dépendante de la ligature (MLPA) et la PCR digitale en gouttelettes (ddPCR)—pour leur fiabilité dans la quantification des copies de SMN1 et SMN2.
Aperçu Technique de la MLPA et de la ddPCR
La MLPA est une méthode semi-quantitative basée sur la PCR, utilisant l’hybridation et la ligature de sondes pour détecter les variations du nombre de copies (CNV). Le processus comprend cinq étapes : dénaturation de l’ADN, hybridation des sondes, ligature, amplification PCR et électrophorèse capillaire. Les résultats sont interprétés en comparant les rapports de pics des séquences cibles à des sondes de référence. Cependant, la MLPA présente des limites intrinsèques : nécessité d’un échantillon d’ADN de référence pour la normalisation, ratio maximal interprétable de 2,15 (limitant la détection à ≤4 copies), et résultats ambigus pour les échantillons hors de cette plage.
La ddPCR, en revanche, partitionne l’ADN en milliers de gouttelettes de l’ordre du nanolitre, permettant une quantification absolue sans étalons de référence. Chaque gouttelette subit une amplification PCR indépendante, et les signaux fluorescents sont comptés pour déterminer la concentration cible. Cette méthode élimine la normalisation et offre une haute précision, même pour des copies élevées (>4).
Performance Comparative dans l’Analyse des Copies
L’étude a analysé 27 échantillons, incluant 24 patients AMS d’un essai clinique (NCT04010604) et trois lignées d’iPSC humaines (i-1, i-2, i-3) de la Coriell Cell Repositories. Les iPSC représentaient des AMS de type I (2 ou 3 copies de SMN2) et de type II (3 copies de SMN2).
Limites de la MLPA
La MLPA a généré des résultats non fiables pour 7/27 échantillons (SMN1) et 19/27 (SMN2) en raison de ratios ambigus ou d’incohérences entre tests dupliqués. Pour SMN1, la reproductibilité était de 74,1 % (20/27), contre 29,6 % (8/27) pour SMN2. La MLPA n’a pas quantifié précisément les copies de SMN2 dans les iPSC : i-1 a montré des résultats discordants (2 copies au Test 1 vs 3 au Test 2), tandis que i-2 et i-3 dépassaient systématiquement la plage détectable (>4 copies), contredisant les valeurs de Coriell. Ces résultats soulignent l’incapacité de la MLPA à résoudre les copies au-delà de ses seuils prédéfinis.
Supériorité de la ddPCR
La ddPCR a démontré une reproductibilité de 100 % (27/27) pour SMN1 et SMN2. Elle a résolu les ambiguïtés de sept échantillons où la MLPA échouait (ex. P-10, F2-II-2) et a confirmé les copies de SMN2 des iPSC (i-1 : 2 ; i-2/i-3 : 3), en accord avec les phénotypes. De plus, la ddPCR a clarifié un cas rare de fratrie AMS : la MLPA rapportait initialement 4 copies (probande F1-II-2) et 2 (sœur F1-II-1), mais un retest suggérait 4 copies pour les deux. L’analyse par ddPCR des PBMC et fibroblastes a confirmé 4 copies chez les deux, indiquant une variabilité phénotypique liée à des modulateurs indépendants de SMN2.
Étude de Cas : Mutation SMN1 c.844C>T
Une famille porteuse d’une mutation rare SMN1 (c.844C>T) a été évaluée. La MLPA rapportait 1 copie (patient AMS type I) et 2 copies (porteur), mais la ddPCR a détecté 0 et 1 copie, respectivement. Cette divergence souligne la surestimation potentielle de la MLPA en présence de mutations ponctuelles, probablement due à une interférence des sondes. Ce cas confirme la nécessité de combiner ddPCR et séquençage pour clarifier les mutations composées hétérozygotes.
Implications Cliniques et Techniques
La ddPCR est préférable pour l’analyse de routine des copies SMN1/SMN2, notamment dans le dépistage néonatal, le diagnostic des porteurs ou le suivi thérapeutique (ex. traitement par nusinersen). La MLPA reste utile pour détecter des délétions/duplications exoniques mais nécessite des méthodes complémentaires.
Pour les patients atypiques, la ddPCR offre une base fiable pour étudier des modulateurs secondaires (ex. PLS3, ZPR1). Son indépendance vis-à-vis de l’ADN de référence simplifie également les workflows.
Conclusion
Cette étude valide la ddPCR comme méthode supérieure pour la quantification des copies SMN1/SMN2, offrant une reproductibilité et une précision inégalées. Les limites de la MLPA imposent son utilisation conjointe avec la ddPCR pour un profil génétique complet. L’intégration de ces méthodes améliore l’exactitude diagnostique, facilite les stratégies thérapeutiques personnalisées et accélère la recherche sur les modulateurs de l’AMS.
doi : 10.1097/CM9.0000000000001102