L’Héparine Non Fractionnée Atténue la Dysfonction de la Barrière Endothéliale via la Voie Phosphatidylinositol-3 Kinase/Sérine/Thréonine Kinase/Facteur Nucléaire Kappa-B
La lésion pulmonaire aiguë (ALI) est une affection critique caractérisée par une inflammation excessive des poumons, entraînant une morbidité et une mortalité élevées. Malgré des recherches approfondies, les thérapies efficaces pour l’ALI restent limitées. Une caractéristique clé de l’ALI est la perturbation de la barrière endothéliale pulmonaire, qui entraîne une hyperperméabilité vasculaire et un œdème pulmonaire. Les jonctions d’adhérence basées sur la cadhérine endothéliale vasculaire (VE-cadhérine) jouent un rôle crucial dans la régulation de la perméabilité endothéliale. Le lipopolysaccharide (LPS), un composant des bactéries à Gram négatif, induit une hyperperméabilité endothéliale en perturbant les jonctions intercellulaires médiées par la VE-cadhérine. L’héparine non fractionnée (UFH), un anticoagulant couramment utilisé, a montré qu’elle améliorait la fonction de la barrière endothéliale, mais les mécanismes sous-jacents ne sont pas entièrement compris. Cette étude examine les effets protecteurs de l’UFH sur la dysfonction de la barrière endothéliale induite par le LPS et explore l’implication de la voie de signalisation phosphatidylinositol-3 kinase (PI3K)/sérine/thréonine kinase (Akt)/facteur nucléaire kappa-B (NF-κB).
Méthodes
Études sur les Animaux
Des souris mâles C57BL/6 ont été divisées en trois groupes : véhicule, LPS et LPS + UFH. Le LPS (30 mg/kg) a été administré par voie intrapéritonéale pour induire une septicémie. Les souris du groupe LPS + UFH ont reçu une injection sous-cutanée de 8 U d’UFH 30 minutes avant l’administration de LPS. Le tissu pulmonaire a été prélevé six heures après l’injection de LPS pour évaluer la lésion pulmonaire en utilisant le rapport poids humide/sec (W/D) des poumons et l’analyse histologique. Le liquide de lavage bronchoalvéolaire (BALF) a été analysé pour la concentration en protéines, le nombre total de cellules, le pourcentage de polynucléaires neutrophiles (PMN) et les niveaux de facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-α).
Culture Cellulaire et Traitement
Les cellules endothéliales microvasculaires pulmonaires humaines (HPMECs) ont été cultivées et traitées avec du LPS (10 µg/mL) ou du TNF-α (10 ng/mL) pour induire une dysfonction de la barrière endothéliale. L’UFH (10 U/mL) a été ajoutée 30 minutes avant la stimulation par le LPS ou le TNF-α. La résistance électrique transendothéliale (TEER) et les tests de perméabilité à la fluorescéine isothiocyanate-dextran (FITC-dextran) ont été réalisés pour mesurer la fonction de la barrière endothéliale. La coloration par immunofluorescence et l’analyse par Western blot ont été utilisées pour évaluer l’expression de la VE-cadhérine, de la p120-caténine, de la chaîne légère de myosine phosphorylée (p-MLC) et le remodelage de l’actine F. L’activation de la voie PI3K/Akt/NF-κB a été évaluée en mesurant la phosphorylation de l’Akt, de la kinase IκB (IKK) et la translocation nucléaire du NF-κB.
Résultats
L’UFH Atténue la Dysfonction de la Barrière Endothéliale Induite par le LPS In Vivo
L’analyse histopathologique a révélé que le LPS induisait une lésion pulmonaire significative, incluant une infiltration de neutrophiles, un épanchement d’érythrocytes, un effondrement alvéolaire et un épaississement septal. Le prétraitement à l’UFH a considérablement réduit ces changements pathologiques. Le rapport W/D des poumons, une mesure de l’œdème pulmonaire, était significativement plus bas dans le groupe LPS + UFH par rapport au groupe LPS (5,05 ± 0,18 vs. 6,93 ± 0,20, P = 0,0022). L’UFH a également diminué la concentration en protéines (0,32 ± 0,04 vs. 0,57 ± 0,04 mg/mL, P = 0,0092), le nombre total de cellules (3,65 ± 0,78 vs. 9,57 ± 1,23 × 10^5/mL, P = 0,0155), le pourcentage de PMN (22,20% ± 3,92% vs. 88,05% ± 2,88%, P = 0,0002) et les niveaux de TNF-α (189,33 ± 14,19 vs. 460,33 ± 23,48 pg/mL, P = 0,0006) dans le BALF. L’analyse par Western blot a montré que l’UFH empêchait la diminution induite par le LPS de l’expression membranaire de la VE-cadhérine et de la p120-caténine dans le tissu pulmonaire.
L’UFH Réduit l’Hyperperméabilité Induite par le LPS ou le TNF-α In Vitro
Le LPS et le TNF-α ont significativement réduit la TEER et augmenté la perméabilité à la FITC-dextran dans les HPMECs, indiquant une dysfonction de la barrière endothéliale. Le prétraitement à l’UFH a augmenté la TEER (LPS + UFH: 15,84 ± 1,09 vs. LPS: 8,90 ± 0,66 V·cm², P = 0,0056; TNF-α + UFH: 18,15 ± 0,98 vs. TNF-α: 11,28 ± 0,64 V·cm², P = 0,0042) et diminué la perméabilité à la FITC-dextran (LPS + UFH: 39,70 ± 1,98 vs. LPS: 56,25 ± 1,51, P = 0,0027; TNF-α + UFH: 36,51 ± 1,20 vs. TNF-α: 55,42 ± 1,42, P = 0,0005). La coloration par immunofluorescence et l’analyse par Western blot ont révélé que l’UFH empêchait la diminution induite par le LPS ou le TNF-α de l’expression membranaire de la VE-cadhérine et de la p120-caténine, réduisait l’expression de la p-MLC et inhibait le remodelage de l’actine F.
L’UFH Inhibe l’Activation de la Voie PI3K/Akt/NF-κB Induite par le LPS
La stimulation par le LPS a augmenté la phosphorylation de l’Akt et de l’IKK et favorisé la translocation nucléaire du NF-κB dans les HPMECs. Le prétraitement à l’UFH a significativement réduit l’expression de p-Akt (LPS + UFH: 0,466 ± 0,035 vs. LPS: 0,977 ± 0,081, P = 0,0045), de p-IKK (LPS + UFH: 0,578 ± 0,044 vs. LPS: 1,023 ± 0,070, P = 0,0060) et la translocation nucléaire du NF-κB (LPS + UFH: 0,503 ± 0,065 vs. LPS: 1,003 ± 0,077, P = 0,0078). Des effets similaires ont été observés avec l’inhibiteur de la PI3K, la wortmannine, suggérant que les effets protecteurs de l’UFH sont médiés par la voie PI3K/Akt/NF-κB.
Discussion
Cette étude démontre que l’UFH atténue la dysfonction de la barrière endothéliale induite par le LPS en stabilisant la VE-cadhérine et en inhibant la voie de signalisation PI3K/Akt/NF-κB. Les jonctions d’adhérence basées sur la VE-cadhérine sont essentielles pour maintenir l’intégrité de la barrière endothéliale. Le LPS et le TNF-α perturbent ces jonctions en induisant l’internalisation de la VE-cadhérine, entraînant une hyperperméabilité endothéliale. L’UFH prévient cette perturbation en maintenant l’expression membranaire de la VE-cadhérine et de la p120-caténine, en réduisant l’expression de la p-MLC et en inhibant le remodelage de l’actine F.
La voie PI3K/Akt/NF-κB joue un rôle central dans la régulation de la fonction de la barrière endothéliale. Le LPS active cette voie, entraînant une augmentation de la phosphorylation de l’Akt et de l’IKK, et la translocation nucléaire du NF-κB, ce qui favorise l’inflammation et les dommages endothéliaux. L’UFH inhibe cette voie, réduisant ainsi l’hyperperméabilité endothéliale et l’inflammation. Les résultats sont cohérents avec les études précédentes montrant que l’UFH atténue la sécrétion d’interleukine-8 (IL-8) induite par le LPS et la dysfonction de la barrière endothéliale via la voie PI3K/Akt/NF-κB.
En conclusion, l’UFH protège contre la dysfonction de la barrière endothéliale induite par le LPS en stabilisant la VE-cadhérine et en inhibant la voie PI3K/Akt/NF-κB. Ces résultats suggèrent que l’UFH pourrait avoir un potentiel thérapeutique pour l’ALI et d’autres affections caractérisées par une perturbation de la barrière endothéliale. Les études futures devraient explorer les effets de l’UFH dans des contextes cliniques et étudier son potentiel en tant que traitement pour l’ALI.
doi.org/10.1097/CM9.0000000000000905