Le miR-485-3p exosomal dérivé des cellules épithéliales canalaires pancréatiques inhibe la métastase du cancer du pancréas en ciblant PAK1
Introduction
La compétition cellulaire est un phénomène biologique où différents types de cellules au sein d’un tissu rivalisent pour leur survie et leur croissance. Ce processus joue un rôle critique dans l’homéostasie des organes, le maintien de la fonction immunitaire et le développement des tumeurs. Dans le cancer du pancréas (CP), la compétition cellulaire implique des interactions entre les cellules cancéreuses pancréatiques, les cellules stellaires pancréatiques (CSP) et les cellules épithéliales canalaires pancréatiques normales. Cependant, les mécanismes sous-jacents à cette compétition restent mal compris.
Les exosomes, des vésicules extracellulaires de taille nanométrique libérées par presque tous les types de cellules, sont apparus comme des médiateurs clés de la communication intercellulaire. Ils transportent diverses biomolécules, y compris des microARN (miARN), qui régulent l’expression des gènes et influencent la progression du cancer. Alors que la plupart des études se sont concentrées sur les exosomes dérivés des cellules tumorales ou stromales, des preuves récentes suggèrent que les exosomes des cellules normales peuvent également moduler le comportement du cancer. Par exemple, l’ARN long non codant PTENP1 exosomal provenant de cellules vésicales normales inhibe la malignité des cellules cancéreuses. Cette étude examine si les miARN exosomaux des cellules épithéliales canalaires pancréatiques normales peuvent supprimer la progression du cancer du pancréas.
Méthodes
Des échantillons cliniques ont été obtenus auprès de 46 patients diagnostiqués avec un cancer du pancréas à l’hôpital universitaire de Pékin entre 2013 et 2017. Les échantillons de tissus ont été conservés dans l’azote liquide, et une approbation éthique a été obtenue. Les cellules stellaires pancréatiques humaines (CSP) ont été isolées à partir de tissus de CP réséqués, tandis que les cellules épithéliales canalaires pancréatiques normales (hTERT-HPNE) et les lignées cellulaires de CP (AsPC-1, BxPC-3, MIA PaCa-2, PANC-1, Patu8988, T3M4) ont été cultivées dans des conditions standard.
Les exosomes ont été isolés à partir de hTERT-HPNE, de CSP et de lignées cellulaires de CP en utilisant l’ultracentrifugation ou des kits ExoQuick-tc. La morphologie et la distribution de taille des exosomes ont été analysées par microscopie électronique à transmission et par analyse de suivi de nanoparticules. Les marqueurs exosomaux CD9, CD63 et TSG101 ont été détectés par Western blot.
La prolifération cellulaire a été évaluée à l’aide d’essais CCK-8, tandis que la migration et l’invasion ont été évaluées à l’aide d’essais Transwell. Les exosomes ont été marqués avec PKH-67 pour suivre leur internalisation dans les cellules réceptrices. L’isolement de l’ARN et la PCR en temps réel ont été réalisés pour mesurer l’expression de miR-485-3p et de PAK1. Des essais de rapporteur de luciférase double ont été menés pour valider la liaison de miR-485-3p à la région 3′ non traduite (3’UTR) de PAK1.
Pour les études in vivo, des cellules BxPC-3 transfectées avec un mimétique ou un inhibiteur de miR-485-3p ont été injectées dans des souris nues pour évaluer la métastase. L’imagerie bioluminescente et l’immunohistochimie ont été utilisées pour évaluer la croissance tumorale et l’expression de PAK1.
Résultats
Les exosomes de hTERT-HPNE suppriment la migration et l’invasion des cellules de CP
Les exosomes isolés de hTERT-HPNE (ExohTERT-HPNE) ont présenté une morphologie et une distribution de taille typiques des exosomes. Les ExohTERT-HPNE marqués avec PKH-67 ont été internalisés par les cellules de CP (BxPC-3 et PANC-1) et les CSP, comme confirmé par microscopie confocale. Bien que les ExohTERT-HPNE n’aient pas affecté la prolifération des cellules de CP, ils ont significativement supprimé la migration et l’invasion dans les cellules BxPC-3 et PANC-1.
Les exosomes de hTERT-HPNE inhibent la migration et la sécrétion des CSP
Les ExohTERT-HPNE ont également supprimé la migration des CSP sans affecter leur prolifération. De plus, les ExohTERT-HPNE ont régulé à la baisse la sécrétion de fibronectine 1 (FN1), de collagène de type alpha 1 (COLIA1) et de protéine d’activation des fibroblastes alpha (FAP) dans les CSP, des facteurs clés contribuant au stroma du CP et au microenvironnement immunosuppresseur.
Le miR-485-3p exosomal est régulé à la baisse dans les cellules de CP et les CSP
Le séquençage des miARN a révélé que miR-485-3p était enrichi dans les ExohTERT-HPNE mais absent dans les exosomes des CSP et des cellules de CP. La RT-PCR a confirmé des niveaux plus bas de miR-485-3p dans les CSP et les cellules de CP par rapport aux cellules canalaires pancréatiques normales. Les données cliniques ont montré que miR-485-3p était significativement diminué dans 78,3 % des tissus de CP et était négativement associé à l’invasion lymphovasculaire.
Les ExohTERT-HPNE ont livré du miR-485-3p mature dans les cellules de CP et les CSP, comme en témoignent les niveaux accrus de miR-485-3p dans les cellules réceptrices. Cela suggère que les ExohTERT-HPNE transfèrent directement miR-485-3p plutôt que de stimuler sa production.
Le miR-485-3p régule la migration et l’invasion des cellules de CP
La surexpression de miR-485-3p dans les cellules BxPC-3 et PANC-1 a inhibé la migration et l’invasion, tandis que le silence de miR-485-3p a eu l’effet inverse. Dans les CSP, la surexpression ou le silence de miR-485-3p n’a pas significativement affecté la migration mais a légèrement modifié la sécrétion de COLIA1.
La régulation à la hausse de miR-485-3p améliore les effets inhibiteurs des ExohTERT-HPNE
La surexpression de miR-485-3p dans hTERT-HPNE a renforcé les effets inhibiteurs des ExohTERT-HPNE sur la migration et l’invasion des cellules de CP. Inversement, la suppression de miR-485-3p n’a pas aboli ces effets, indiquant que miR-485-3p n’est pas le seul médiateur de l’activité des ExohTERT-HPNE.
Le miR-485-3p cible directement PAK1 pour supprimer la métastase du CP
L’analyse bioinformatique a identifié PAK1 comme une cible potentielle de miR-485-3p. Les essais de rapporteur de luciférase double ont confirmé la liaison de miR-485-3p à la 3’UTR de PAK1. Dans les tissus de CP, les niveaux de miR-485-3p étaient négativement corrélés à l’expression de PAK1. Les ExohTERT-HPNE et le mimétique de miR-485-3p ont réduit l’expression de PAK1 dans les cellules BxPC-3, tandis que l’inhibiteur de miR-485-3p l’a augmentée.
Les études in vivo ont démontré que la surexpression de miR-485-3p inhibait la métastase du CP et réduisait les niveaux de PAK1 dans les tissus pulmonaires, tandis que le silence de miR-485-3p favorisait la métastase et augmentait l’expression de PAK1.
Le miR-485-3p médie les effets inhibiteurs des ExohTERT-HPNE via PAK1
La surexpression stable de PAK1 dans les cellules BxPC-3 a restauré la migration et l’invasion supprimées par les ExohTERT-HPNE. L’inhibition de miR-485-3p a encore augmenté l’expression de PAK1 et renforcé ces effets. Cela confirme que miR-485-3p médie les effets inhibiteurs des ExohTERT-HPNE en ciblant PAK1.
Discussion
Cette étude révèle un nouveau mécanisme de compétition cellulaire dans le cancer du pancréas, où les cellules épithéliales canalaires pancréatiques normales libèrent des exosomes contenant miR-485-3p pour supprimer les comportements malins des cellules de CP et des CSP. Le miR-485-3p exosomal cible directement PAK1, inhibant la migration, l’invasion et la métastase des cellules de CP.
PAK1, une sérine/thréonine kinase, est régulé à la hausse dans le cancer du pancréas et favorise la progression tumorale. En régulant à la baisse PAK1, miR-485-3p exerce des effets anti-tumoraux, soulignant son potentiel en tant que cible thérapeutique. La restauration de miR-485-3p par le biais d’exosomes ou d’autres véhicules de livraison pourrait offrir une nouvelle approche pour le traitement du cancer du pancréas.
Bien que miR-485-3p joue un rôle central dans la médiation des effets des ExohTERT-HPNE, d’autres molécules au sein de ces exosomes peuvent également contribuer à leur activité inhibitrice. Des recherches supplémentaires sont nécessaires pour identifier les facteurs supplémentaires impliqués dans ce processus.
Conclusion
Le miR-485-3p exosomal dérivé des cellules épithéliales canalaires pancréatiques normales inhibe la métastase du cancer du pancréas en ciblant PAK1. Cette découverte souligne l’importance de la compétition cellulaire dans la progression tumorale et fournit une base pour le développement de thérapies basées sur miR-485-3p pour le cancer du pancréas.
doi.org/10.1097/CM9.0000000000002154