Le DnaJA4 est impliqué dans les réponses à l’hyperthermie en régulant l’expression de la F-actine dans les cellules HaCaT
Introduction
L’actine est une protéine multifonctionnelle hautement conservée présente dans toutes les cellules eucaryotes, avec une masse d’environ 42 kDa. Elle existe sous deux formes : l’actine globulaire (G-actine), un monomère sphérique, et l’actine filamenteuse (F-actine), un polymère constituant le principal composant du cytosquelette. Ces deux formes peuvent se convertir réversiblement sous certaines conditions physiologiques, mais seule la F-actine possède une activité physiologique. L’actine participe à des processus cellulaires critiques, incluant l’établissement et le maintien des jonctions cellulaires, la migration, la signalisation, la phagocytose, l’apoptose et la prolifération.
Les protéines de choc thermique (HSPs) sont des protéines de réponse aiguë hautement conservées, dont l’expression augmente sous stress, comme l’hyperthermie ou les rayons UVB. Parmi elles, les DnaJ/HSP40 (d’un poids moléculaire d’environ 40 000 Da) agissent comme co-chaperonnes de la HSP70 pour protéger les cellules endommagées. L’hyperthermie, définie par une exposition de 30 à 60 minutes à une température de 40–44°C, est utilisée en clinique pour traiter diverses pathologies, comme le cancer du sein ou les verrues plantaires.
Des études antérieures ont montré que l’expression de DnaJA4 dans les cellules HaCaT augmente après hyperthermie, modulant l’immunité antivirale. Une analyse par spectrométrie de masse a révélé que DnaJA4 interagit avec les protéines du cytosquelette, notamment la tubuline et l’actine. Cette étude explore le rôle de DnaJA4 dans la régulation de la F-actine lors de l’hyperthermie.
Méthodes
Lignées cellulaires et culture
Des cellules HaCaT de type sauvage (WT) et des cellules DnaJA4-KO (obtenues par CRISPR/Cas9) ont été cultivées en milieu DMEM avec 10 % de sérum fœtal et 1 % de pénicilline/streptomycine à 37°C sous 5 % de CO₂.
Traitement par hyperthermie
Les cellules, cultivées à 60–70 % de confluence, ont été exposées à 44°C (±0,1°C) pendant 30 minutes dans un bain-marie, puis récupérées à 37°C pendant 6, 12 ou 24 heures.
Marquage de la F-actine
Les cellules fixées au paraformaldéhyde 4 % et perméabilisées au Triton X-100 0,1 % ont été incubées avec de la phalloïdine conjuguée à l’Alexa Fluor 488. Les noyaux ont été colorés au DAPI et observés par microscopie confocale.
Cytométrie en flux
Les cellules fixées et perméabilisées ont été incubées avec un anticorps anti-F-actine marqué à l’Alexa Fluor 488. L’intensité fluorescente a été mesurée sur un cytomètre BD LSRFortessa (10 000 cellules analysées).
Western Blot
Les lysats cellulaires ont été séparés par électrophorèse SDS-PAGE, transférés sur membrane et incubés avec des anticorps anti-F-actine, RhoA, ROCK1, E-cadhérine, β-caténine et GAPDH. Les signaux ont été détectés par chimiluminescence.
Résultats
Modifications morphologiques induites par l’hyperthermie
Les cellules WT non traitées présentaient des filopodes et une croissance dispersée, tandis que les cellules DnaJA4-KO montraient des connexions intercellulaires serrées. Après hyperthermie, les cellules WT se rétractaient à 6 heures, puis récupéraient à 24 heures avec une augmentation des filopodes. Aucun changement morphologique significatif n’a été observé dans les cellules DnaJA4-KO.
Régulation de la F-actine par DnaJA4
La cytométrie en flux a révélé une intensité fluorescente plus élevée dans les cellules DnaJA4-KO (6 364,33 ± 989,10 vs 4 272,67 ± 918,50; p = 0,014). En Western Blot, l’expression de la F-actine diminuait à 6 heures post-hyperthermie dans les cellules WT, puis revenait au niveau basal. Dans les cellules DnaJA4-KO, elle dépassait le niveau basal à 24 heures (0,51 ± 0,02 vs 0,44 ± 0,01; p = 0,001). Les protéines RhoA et ROCK1 suivaient un profil similaire.
Effet sur l’E-cadhérine
L’expression de l’E-cadhérine diminuait à 24 heures dans les deux lignées, mais restait plus élevée dans les cellules DnaJA4-KO (0,47 ± 0,01 vs 0,28 ± 0,01; p = 0,036). Aucun changement significatif n’a été observé pour la β-caténine.
Discussion
L’hyperthermie provoque une dépolymérisation initiale de la F-actine, suivie d’une repolymérisation médiée par les HSPs. La délétion de DnaJA4 augmente l’agrégation de la F-actine, suggérant un rôle inhibiteur de DnaJA4 dans ce processus. La voie RhoA/ROCK1, essentielle à la dynamique de l’actine, est également régulée par DnaJA4. La réduction des filopodes dans les cellules DnaJA4-KO pourrait influencer la transmission virale, tandis que la modulation de l’E-cadhérine pourrait affecter la prolifération ou l’apoptose.
Conclusion
DnaJA4 module la réponse à l’hyperthermie dans les cellules HaCaT via la régulation de la F-actine et des voies associées. Des études futures, incluant un modèle de surexpression de DnaJA4, seront nécessaires pour préciser ces mécanismes.
doi.org/10.1097/CM9.0000000000001064