L’ARN Long Non-Codant PVT1 Exacerbe les Lésions Cardiomyocytaires Induites par l’Hypoxie via l’Axe miR-135a-5p/FOXO1
L’infarctus du myocarde (IM) reste une cause majeure de morbidité et de mortalité mondiales, principalement en raison des lésions cardiomyocytaires prolongées induites par l’ischémie. L’hypoxie, caractéristique pathologique centrale de l’IM, déclenche un stress oxydatif, une apoptose et un dysfonctionnement mitochondrial dans les cardiomyocytes. Bien que les ARN longs non codants (lncARN) soient des régulateurs clés des maladies cardiovasculaires, leur rôle dans les lésions myocardiques hypoxiques reste mal élucidé. Cette étude révèle le rôle mécanistique du lncARN PVT1 (plasmocytome variant translocation 1) dans les lésions induites par l’hypoxie dans les cardiomyocytes H9c2 de rat, en identifiant son interaction avec le microARN-135a-5p (miR-135a-5p) et la régulation subséquente du facteur de transcription FOXO1 (forkhead box O1).
L’Hypoxie Induit une Surexpression de PVT1 dans les Cardiomyocytes H9c2
Pour modéliser les lésions hypoxiques, les cellules H9c2 ont été exposées à un environnement hypoxique (1 % O₂, 5 % CO₂, 94 % N₂) pendant 3 à 24 heures. L’hypoxie a réduit significativement la viabilité cellulaire de manière dépendante du temps, avec une chute à 52 % à 12 heures et 38 % à 24 heures par rapport aux témoins normoxiques (P < 0,05). L’apoptose, mesurée par marquage Annexine V/PI et cytométrie en flux, est passée de 5,8 % sous normoxie à 29,4 % après 12 heures d’hypoxie (P < 0,05). Le Western blot a confirmé une augmentation des niveaux de la protéine pro-apoptotique Bax (×2,8) et une réduction de la protéine anti-apoptotique Bcl-2 (-60 %). Fait marquant, l’expression de PVT1, quantifiée par qRT-PCR, a augmenté de 3,5 fois sous hypoxie, suggérant son implication potentielle dans les lésions hypoxiques.
L’Inhibition de PVT1 Atténue l’Apoptose Induite par l’Hypoxie
Pour étudier le rôle fonctionnel de PVT1, les cellules H9c2 ont été transfectées avec un ARN court en épingle à cheveu ciblant PVT1 (shPVT1), entraînant une réduction de 65 % de l’ARNm de PVT1 par rapport aux témoins (P < 0,05). Le silençage de PVT1 a restauré la viabilité cellulaire à 78 % (contre 52 % sous hypoxie avec shControl) et réduit l’apoptose à 12,3 %. Le Western blot a montré une diminution de 50 % des niveaux de Bax et une augmentation de 1,8 fois de Bcl-2. Ces résultats démontrent que PVT1 aggrave les lésions cardiomyocytaires hypoxiques.
PVT1 Agit comme un Éponge pour miR-135a-5p
L’analyse bioinformatique (LncBase Predicted v.2) a identifié miR-135a-5p comme miRNA potentiellement lié à PVT1. Des tests de luciférase ont confirmé une interaction directe : la co-transfection de miR-135a-5p avec PVT1 sauvage (PVT1-WT) a réduit l’activité luciférasique de 40 % (P < 0,05), tandis que des mutations du site de liaison (PVT1-MT) ont aboli cet effet. L’immunoprécipitation de l’ARN (RIP) avec un anticorps anti-Ago2 a révélé un enrichissement de 4,2 fois pour PVT1 et 3,8 fois pour miR-135a-5p dans les fractions liées à Ago2, confirmant leur interaction au sein du complexe RISC.
La surexpression de PVT1 (via pcDNA3.1/PVT1) a réduit les niveaux de miR-135a-5p de 55 %, tandis que son inhibition a augmenté l’expression de miR-135a-5p de 2,1 fois (P < 0,05). L’hypoxie elle-même a supprimé miR-135a-5p de 60 %, positionnant PVT1 comme un régulateur négatif de miR-135a-5p sous stress hypoxique.
La Surexpression de miR-135a-5p Atténue les Lésions Hypoxiques
La transfection de miR-135a-5p dans les cellules hypoxiques a augmenté son expression de 3,3 fois, restaurant la viabilité à 85 % et réduisant l’apoptose à 14,6 % (P < 0,05 vs. témoin). À l’inverse, l’inhibition de miR-135a-5p a accru l’apoptose à 34,7 %. La co-transfection de PVT1 avec miR-135a-5p a annulé ces effets protecteurs, réduisant la viabilité à 63 % et augmentant l’apoptose à 25,8 %, confirmant la dépendance de PVT1 à miR-135a-5p.
FOXO1 est une Cible Directe de miR-135a-5p
TargetScan a prédit FOXO1, un facteur transcriptionnel impliqué dans l’apoptose, comme cible de miR-135a-5p. Les tests de luciférase ont validé cette interaction : miR-135a-5p a réduit l’activité de FOXO1 sauvage de 45 % (P < 0,05), sans effet sur FOXO1 muté. L’hypoxie a augmenté les niveaux de FOXO1 de 2,5 fois, atténués par miR-135a-5p (-60 %) et exacerbés par son inhibition (×1,8).
L’Axe PVT1/miR-135a-5p Régule l’Apoptose via FOXO1
L’inhibition de FOXO1 (shFOXO1) a réduit l’apoptose à 11,2 % sous hypoxie, reproduisant les effets de miR-135a-5p. La co-transfection de shFOXO1 avec un inhibiteur de miR-135a-5p a annulé cette protection. La surexpression de PVT1 a augmenté FOXO1 de 2,2 fois, tandis que son inhibition l’a réduit de 50 % (P < 0,05). Critiquement, les effets pro-apoptotiques de PVT1 ont été abolis par shFOXO1, restaurant la viabilité à 80 % et réduisant l’apoptose à 13,4 %, confirmant FOXO1 comme effecteur clé.
Implications Mécanistiques et Thérapeutiques
Cette étude révèle un axe PVT1/miR-135a-5p/FOXO1 où l’hypoxie surexprime PVT1, séquestrant miR-135a-5p et levant la répression de FOXO1, favorisant l’apoptose via Bax/Bcl-2. Les inhibiteurs de PVT1 ou les mimétiques de miR-135a-5p pourraient atténuer l’apoptose post-IM, offrant de nouvelles stratégies thérapeutiques.
Validation Expérimentale et Rigueur Technique
Les méthodes incluaient :
- Tests CCK-8 : Viabilité cellulaire.
- Cytométrie en flux : Apoptose via Annexine V/PI.
- qRT-PCR : Quantification des ARN, normalisés à GAPDH/U6.
- Western blot : Protéines Bax, Bcl-2, FOXO1.
- Luciférase : Interactions miRNA-ARNm.
- RIP : Liaison PVT1/miR-135a-5p dans le RISC.
Les analyses statistiques ont utilisé des tests t de Student ou ANOVA (P < 0,05).
Conclusion
Cette étude établit PVT1 comme un régulateur clé de l’apoptose cardiomyocytaire hypoxique via l’axe miR-135a-5p/FOXO1, éclairant les mécanismes moléculaires de l’IM et ouvrant la voie à des thérapies ciblant les ARN non codants.
doi.org/10.1097/CM9.0000000000001147