Immortalisation médiée par la télomérase des fibroblastes de la paroi vaginale humaine dérivés de patientes atteintes de prolapsus des organes pelviens
Le prolapsus des organes pelviens (POP) est une affection prévalente chez les femmes, caractérisée par un dysfonctionnement des tissus de soutien du plancher pelvien. L’incidence du POP varie de 3,40 % à 10,76 %, avec les interventions chirurgicales comme traitement principal. Cependant, les complications associées au maillage transvaginal (TVM) ont conduit à son interdiction par la FDA en 2019, incitant les chercheurs à explorer l’ingénierie tissulaire comme alternative. Les fibroblastes jouent un rôle crucial dans le remodelage de la matrice extracellulaire (MEC), un mécanisme pathologique clé du POP. Cependant, la capacité limitée de passage des fibroblastes de la paroi vaginale humaine (hVWFs) in vitro pose des défis importants pour la recherche et les applications thérapeutiques. Cette étude visait à immortaliser les hVWFs par l’introduction de la transcriptase inverse de la télomérase humaine (hTERT) pour surmonter ces limitations.
L’étude a été menée conformément à la Déclaration d’Helsinki et approuvée par le Comité d’éthique de l’institution. Les tissus de la paroi vaginale ont été prélevés chez des patientes subissant une chirurgie pour prolapsus de la paroi vaginale antérieure. Les hVWFs primaires ont été isolés et cultivés, avec la sénescence cellulaire détectée par coloration à la β-galactosidase associée à la sénescence (SA-β-gal). Des vecteurs de transfection lentiviraux ont été utilisés pour exprimer de manière stable hTERT dans les hVWFs au passage 3, générant des hVWFs immortalisés (i-hVWFs). La prolifération cellulaire a été évaluée à l’aide des tests CCK-8 et EdU, tandis que la migration cellulaire a été évaluée par des tests de cicatrisation. L’analyse du caryotype chromosomique par bande G a été réalisée pour évaluer la stabilité chromosomique, et la capacité de tumorigenèse in vivo a été évaluée chez des souris nues.
Les résultats ont montré que les hVWFs primaires présentaient une sénescence significative à partir du passage sept. Au passage 11, les hVWFs ont montré un pourcentage de sénescence significativement plus élevé que les i-hVWFs. Les cellules immortalisées ont maintenu une stabilité dans la prolifération, la capacité de migration, l’expression des gènes liés à la régulation de la MEC et le caryotype chromosomique tout au long des passages continus. Surtout, les i-hVWFs n’ont pas montré de potentiel tumorigène in vivo.
L’isolement et la culture des hVWFs primaires ont révélé que ces cellules pouvaient être cultivées en série pendant 16 à 18 passages, avec une sénescence augmentant progressivement. La coloration SA-β-gal a confirmé que le pourcentage de cellules sénescentes augmentait significativement à partir du passage sept, atteignant près de 100 % au passage 18. En revanche, les i-hVWFs ont montré un pourcentage de sénescence stable entre 12,8 % et 15,4 % à partir du passage 11, indiquant une immortalisation réussie.
La surexpression de hTERT dans les hVWFs a été confirmée par RT-qPCR et Western blot. L’expression de l’ARNm de hTERT était négative dans les hVWFs mais positive dans les i-hVWFs, avec des niveaux de protéines 18,36 fois plus élevés dans les i-hVWFs. La coloration par immunofluorescence a localisé la protéine hTERT dans le noyau cellulaire, conformément à son rôle dans le maintien des télomères.
Les tests de prolifération et de migration ont démontré que les i-hVWFs conservaient des caractéristiques fonctionnelles similaires aux hVWFs primaires. Au passage 5, aucune différence significative n’a été observée dans la prolifération ou la migration entre les hVWFs et les i-hVWFs. Cependant, au passage 11, les i-hVWFs ont montré des taux de prolifération et de migration significativement plus élevés que les hVWFs. Les passages continus des i-hVWFs jusqu’au passage 30 ont révélé des capacités de prolifération et de migration stables, indiquant la robustesse du processus d’immortalisation.
L’expression des gènes liés à la régulation de la MEC, y compris COL1A1, COL3A1, ELN, MMP2, MMP3, MMP9, TIMP1 et TIMP2, a été évaluée dans les i-hVWFs. La RT-qPCR et le Western blot ont confirmé une expression stable de ces gènes aux passages 5, 10, 20 et 30, indiquant que l’immortalisation par hTERT n’a pas altéré les attributs fonctionnels clés des hVWFs.
La stabilité chromosomique a été évaluée par analyse du caryotype chromosomique par bande G, qui a révélé un caryotype féminin normal dans les hVWFs et les i-hVWFs. Cette constatation souligne la stabilité génétique des cellules immortalisées, un facteur critique pour leur utilisation dans la recherche et les applications thérapeutiques.
Les tests de tumorigenèse in vivo ont été réalisés pour évaluer la sécurité des i-hVWFs. L’injection sous-cutanée des i-hVWFs chez des souris nues n’a pas entraîné de formation de tumeur, tandis que les injections de contrôle de cellules HeLa ont conduit au développement de tumeurs dans tous les cas. Cette absence de potentiel tumorigène soutient davantage la sécurité et l’adéquation des i-hVWFs pour les études futures.
Les résultats de l’étude mettent en évidence le potentiel de l’immortalisation médiée par hTERT pour surmonter les limitations associées aux hVWFs primaires. En prolongeant la durée de vie de ces cellules tout en maintenant leur stabilité fonctionnelle et génétique, les i-hVWFs fournissent un modèle précieux pour étudier le POP et développer de nouvelles stratégies thérapeutiques. La capacité à générer une lignée cellulaire cohérente et reproductible à partir de patientes atteintes de POP répond aux défis de l’hétérogénéité cellulaire et de la disponibilité limitée des échantillons chirurgicaux.
En conclusion, cette étude a réussi à immortaliser les hVWFs dérivés de patientes atteintes de POP par l’introduction de hTERT. Les cellules immortalisées ont montré une prolifération stable, une migration et une expression de gènes liés à la régulation de la MEC, ainsi qu’un caryotype chromosomique normal et une absence de potentiel tumorigène. Ces caractéristiques font des i-hVWFs un outil prometteur pour faire avancer la recherche sur le POP et explorer de nouvelles options de traitement. Le développement de cette lignée cellulaire immortalisée représente une avancée significative dans la compréhension de la pathophysiologie du POP et l’amélioration des résultats pour les patients.
doi.org/10.1097/CM9.0000000000002278