Cryoconservation à domicile des échantillons fécaux : Une stratégie efficace pour les études longitudinales utilisant des approches multi-omiques
Le microbiote intestinal humain joue un rôle crucial dans le maintien de la santé et l’influence des issues de maladies. Les interactions dynamiques entre les microbes intestinaux et leur hôte sont complexes, rendant difficile l’utilisation de souches microbiennes uniques ou de signatures comme marqueurs fiables pour la prédiction du risque de maladie ou l’évaluation des résultats. Pour mieux comprendre ces interactions, les approches multi-omiques sont devenues des outils essentiels pour analyser le microenvironnement intestinal. Cependant, les études longitudinales nécessitant un échantillonnage fécal fréquent font face à des défis importants, notamment en matière de stockage, de transport et de manipulation des échantillons. Cette étude évalue la faisabilité de la cryoconservation à domicile des échantillons fécaux à -20°C pendant un mois, en la comparant à la pratique standard de stockage immédiat à -80°C, afin de déterminer si cette méthode peut préserver efficacement le microenvironnement intestinal pour l’analyse multi-omique.
Contexte et justification
Le microenvironnement intestinal est hautement dynamique, avec des changements significatifs survenant sur de courtes périodes, en particulier pendant les phases aiguës de maladies telles que la maladie inflammatoire de l’intestin (MII). Pour capturer ces changements, un échantillonnage fréquent—tous les 2 à 3 jours—est nécessaire. Cependant, la composition microbienne des échantillons fécaux stockés à température ambiante pendant plus de 24 heures est significativement altérée, rendant la cryoconservation immédiate critique. Bien que le stockage à -80°C soit la norme, il est souvent impraticable pour les études longitudinales à domicile. Une approche alternative est le stockage à -20°C, plus accessible pour les participants. Cette étude visait à évaluer si les échantillons fécaux stockés à -20°C pendant un mois pouvaient maintenir l’intégrité du microenvironnement intestinal pour l’analyse multi-omique, y compris le profilage microbien, fongique et des acides biliaires (AB).
Conception de l’étude et méthodologie
Des échantillons fécaux ont été collectés tous les trois jours auprès de trois volontaires sains pendant un mois. Chaque échantillon a été divisé en deux contenants stériles contenant un tampon de stabilisation et stockés soit à -80°C soit à -20°C dans l’heure suivant l’évacuation. Au total, 60 échantillons ont été collectés pour le séquençage du gène 16S rRNA et de la région ITS1, et 24 échantillons ont été collectés pour l’analyse des AB. Bien que la plupart des échantillons aient été collectés à des intervalles de trois jours, huit échantillons ont subi un délai de plus d’un jour. La qualité de l’ARN fongique était faible dans 24 des 60 échantillons, ce qui a été attribué à l’instabilité de l’ADN fongique pendant la cryoconservation.
Analyse des communautés microbiennes et fongiques
L’étude a identifié un total de 140 genres bactériens dans tous les échantillons, avec une médiane de 74 genres par échantillon. Les 20 genres les plus abondants représentaient 74% à 95% de la communauté microbienne totale. Aucune différence significative n’a été observée dans le nombre total de genres microbiens ou dans les genres dominants entre les échantillons stockés à -80°C et à -20°C. Cependant, des fluctuations dans le nombre de genres microbiens ont été observées sur de courtes périodes chez les individus, même parmi ceux ayant des habitudes alimentaires stables.
Des analyses de diversité alpha et bêta ont été réalisées pour évaluer les changements temporels dans la diversité microbienne au sein des individus et entre les températures de stockage. La diversité alpha, mesurée à l’aide des indices de Shannon et Simpson, a montré que la diversité microbienne variait entre les individus mais n’était pas significativement affectée par la température de stockage ou le temps. L’analyse en composantes principales basée sur les distances de Bray-Curtis a révélé que les différences individuelles expliquaient la majeure partie de la variance dans la composition microbienne (R2 = 0,68), tandis que la variance due aux décalages temporels dans l’échantillonnage (R2 = 0,03) était plus élevée que celle entre les températures de stockage (R2 < 0,01). Les changements temporels dans les communautés microbiennes au sein des individus étaient significatifs, mais ces changements étaient mineurs par rapport aux différences interindividuelles.
L’étude a également évalué la stabilité des communautés fongiques. Un total de 106 genres fongiques a été identifié, avec une médiane de 11,5 genres par échantillon. Aucune différence significative n’a été observée dans le nombre total de genres fongiques entre les températures de stockage. Cependant, les changements temporels dans la diversité fongique au sein des individus étaient plus prononcés que ceux observés pour les bactéries. Les genres fongiques dominants incluaient Saccharomyces, Kazachstania, Aspergillus, Cortinarius et Hygrophorus, avec Saccharomyces étant le plus abondant dans la plupart des échantillons. L’abondance de ces genres variait significativement au fil du temps, reflétant l’instabilité du mycobiote en réponse aux changements alimentaires et aux réponses immunitaires muqueuses temporelles.
Profilage des acides biliaires
Une métabolomique ciblée a été réalisée sur 24 échantillons pour évaluer l’effet des conditions de stockage sur les AB fécaux. Un total de 49 AB a été identifié, avec les AB primaires (par exemple, l’acide chénodésoxycholique) et secondaires (par exemple, l’acide désoxycholique, l’acide isolithocholique, l’acide lithocholique et l’acide ursodésoxycholique) représentant 45% à 88% de tous les AB. Aucune différence significative n’a été observée dans les niveaux totaux d’AB entre les échantillons stockés à -80°C et à -20°C. Cependant, les niveaux de certains AB, y compris l’acide nutriacholique, l’acide alpha-muricholique (MCA), le bêta-MCA et l’acide 3-bêta-désoxycholique, ont diminué lors du stockage à long terme à -20°C par rapport à la méthode de référence. De plus, les niveaux de plusieurs AB, tels que l’acide hyocholique, l’acide glycocholique, le taurolithocholate 3-sulfate et l’acide kétolithocholique, ont été réduits à -20°C même dans les échantillons stockés pendant de courtes périodes.
Analyse de similarité locale étendue (eLSA)
Pour évaluer les fluctuations dynamiques dans l’abondance des genres bactériens pendant le stockage, une analyse de similarité locale étendue (eLSA) a été réalisée. Cette technique est couramment utilisée dans l’analyse des données de séries temporelles pour identifier les modèles temporels d’occurrence des espèces microbiennes. Les résultats ont montré que les changements dans les genres microbiens les plus abondants étaient similaires pour différentes températures de stockage. Cependant, plusieurs genres dominants dans les phyla Bacteroidetes et Firmicutes, y compris Bacteroides, Prevotella_9, Faecalibacterium et Blautia, ont montré de faibles associations locales, suggérant que leur abondance pourrait avoir été compromise par le stockage à -20°C.
Discussion
Les résultats de cette étude démontrent que la cryoconservation à domicile des échantillons fécaux à -20°C pendant un mois est une stratégie viable pour les études longitudinales utilisant des approches multi-omiques. Les communautés microbiennes et fongiques, ainsi que les profils d’AB, ont été largement préservés à cette température, sans différences significatives observées par rapport aux échantillons stockés à -80°C. Cependant, l’étude a également mis en évidence l’instabilité de l’ADN fongique et la dégradation potentielle de certains AB lors du stockage à long terme à -20°C. Ces résultats soulignent la nécessité de stratégies alternatives, pratiques et fiables pour la préservation des échantillons fécaux afin de réduire les biais potentiels dans l’analyse du microbiome.
L’étude a également révélé des changements temporels significatifs dans les communautés microbiennes et fongiques au sein des individus, soulignant la nature dynamique du microenvironnement intestinal. Bien que les différences interindividuelles expliquaient la majeure partie de la variance dans la composition microbienne, les fluctuations résultant des facteurs alimentaires et des réponses immunitaires muqueuses étaient relativement mineures. Le microbiote intestinal dominant au niveau du genre est resté stable au fil du temps et entre différentes températures de stockage, bien que des altérations drastiques dans l’abondance relative des genres dominants aient été observées.
Conclusion
La cryoconservation à domicile des échantillons fécaux à -20°C offre une solution pratique pour les études longitudinales nécessitant un échantillonnage fréquent. Cette méthode préserve efficacement le microenvironnement intestinal pour l’analyse multi-omique, la rendant accessible aux participants sans compromettre l’intégrité des échantillons. Cependant, l’instabilité de l’ADN fongique et la dégradation de certains AB lors du stockage à long terme à -20°C soulignent la nécessité de recherches supplémentaires pour optimiser les techniques de préservation des échantillons. En relevant ces défis, les chercheurs peuvent améliorer la fiabilité des études longitudinales et acquérir des connaissances plus approfondies sur les interactions complexes entre le microbiote intestinal et la santé de l’hôte.
doi.org/10.1097/CM9.0000000000002106